Hodnotenie proliferačnej aktivity malígneho melanómu kože a jej vzťahu s ostatnými histopatologickými parametrami nádoru

Evaluation of the proliferative activity of cutaneous malignant melanoma and its relationship to other histopathological parameters of tumor

BARTOŠ, V.¹, POKORNÝ, D.¹, ZACHAROVÁ, O.¹, KULLOVÁ M.^{2 1)} Oddelenie patologickej anatómie FNsP v Žiline, V. Spanyola 43, Žilina, 012 07 ²⁾ Dermatovenerologické oddelenie, FNsP v Žiline, V. Spanyola 43, Žilina, 012 07

SÚHRN

Úvod: Pri väčšine zhubných nádorov je proliferačná aktivita nádorových buniek jeden z dôležitých histomorfologických parametrov. Cieľ práce: Kvantitívne hodnotenie proliferačnej aktivity malígneho melanómu kože a jej vzťahu s ostatnými histopatologickými parametrami nádoru. Materiál a metódy: Súbor pozostával z 24 biopticky verifikovaných primárnych malígnych melanómov kože v invazívnom štádiu rastu, u ktorých sme proliferačnú aktivitu (Ki-67 index) detegovali imunohistochemicky protilátkou proti Ki-67 antigénu. Rozlišovali sme 3 semikvantitatívne stupne Ki-67 imunoreaktivity: stupeň I ( 20 % pozitívnych buniek). Výsledky: Priemerná hodnota proliferačnej aktivity vyšetrovaných melanómov bola 14,3 %. Najčastejšie sa vyskytoval semikvantitatívny stupeň II (n = 11), po ňom nasledoval stupeň I (n = 9) a stupeň III (n = 4). So stúpajúcim Ki-67 indexom (stupeň I vs. II. vs. III) klesalo zastúpenie „tenkých“ melanómov s hrúbkou ≤ 1 mm (77,8 % vs. 27,3 % vs. 0 %) a stúpal výskyt „hrubých“ melanómov s Breslowým indexom > 4 mm (11,1 % vs. 27,3 % vs. 75 %), narastala priemerná hodnota počtu mitóz (0,9 vs. 4,8 vs. 17 mitóz), častejšie sa vyskytoval nepriaznivý histologický prognostický index ≥ 19 (11,1 % vs. 54,6 % vs. 100 %), stúpal výskyt nádorových satelitov/mikrosatelitov (0 % vs. 9 % vs. 25 %), ako aj invázie nádoru do ciev (11,1 % vs. 18,2 % vs. 50 %). Záver: Hoci sú naše výsledky limitované malým počtom vyšetrovaných lézií, vo všeobecnosti môžeme konštatovať, že narastajúca proliferačná aktivita melanómu bola asociovaná s častejším výskytom nepriaznivých histomorfologických ukazovateľov nádoru.

SUMMARY

Introduction: In the majority of malignant tumors, a proliferative activity of tumor cells is one of the important histomorphological parameters. Aim: Quantitative evaluation of proliferative activity in cutaneous malignant melanoma and its relationship with other histopathological variables of tumor. Material and methods: Study group consisted of 24 bioptically verified primary invasive malignant melanomas of the skin, in which a proliferative activity (Ki-67 index) was immunohistochemically detected by antibody against Ki-67 antigen. We differentiated 3 semiquantitative degrees of Ki-67 immunoreactivity: degree I ( 20 % of positive cells). Results: Mean proliferative activity of melanomas was 14.3 %. Semiquantitative degree II was the most common (n = 11), followed by degree I (n = 9) and degree III (n = 4). As Ki-67 index increased (degree I vs. II. vs. III), percentage of „thin” melanomas with thickness ≤ 1 mm decreased (77,8 % vs. 27,3 % vs. 0 %) and „thick“ melanomas with Breslow index > 4 mm increased (11,1 % vs. 27,3 % vs. 75 %), mean mitotic activity rose (0,9 vs. 4,8 vs. 17 mitotic figures), unfavorable histological prognostic index ≥ 19 occured more commonly (11,1 % vs. 54,6 % vs. 100 %), incidence of tumor satelites / microsatelites (0 % vs. 9 % vs. 25 %), as well as tumor lymphatic invasion (11,1 % vs. 18,2 % vs. 50 %) increased. Conclusion: Although our results are limited due to small number of investigated lesions, we can generally conclude, rising proliferative activity of melanoma was associated with an increased incidence of the unfavorable histomorphological parameters of disease.

Kľúčové slová: malígny melanóm, proliferač-Key words: malignant melanoma, proliferatiná aktivita, Ki-67 index ve activity, Ki-67 index

Úvod

Malígny melanóm kože patrí v súčasnosti medzi najintenzívnejšie študované onkologické choroby. Vo veľkej miere sa na tom podieľa celosvetový nárast jeho incidencie (1, 2, 3, 4), ktorý pretrváva aj na Slovensku (1, 5, 6, 7). Prognóza zhubného melanómu závisí od viacerých klinicko-patologických ukazovateľov (8), ktoré ovplyvňujú voľbu liečebnej stratégie a celkový manažment pacienta. Pri väčšine zhubných nádorov patrí proliferačná aktivita (rastová frakcia) nádorových buniek k dôležitému histomorfologickému prognostické-mu parametru. Vo všeobecnosti platí, že vysoký stupeň proliferácie buniek koreluje s rýchlejším rastom, nižším stupňom diferenciácie a agresívnejším biologickým správaním tumoru. Pri bioptickom vyšetrení sa proliferačná aktivita najčastejšie stanovuje imunohistochemicky protilátkou proti Ki-67 antigénu (tzv. Ki-67 index), prípadne proti jadrovému antigénu proliferujúcich buniek (PCNA, proliferating cell nuclear antigen). Ki-67 antigén je nehistónový proteín prítomný v jadrách buniek počas aktívnych fáz bunkového cyklu (G1, S, G2 a mitózy), zatiaľ čo v pokojovej (G0) fáze absentuje (9). Pri jedno-značnej histologickej diag nóze malígneho melanómu kože síce nepatrí stanovenie Ki-67 indexu k nevyhnutným parametrom bioptického vyšetrenia, avšak väčšina štúdií poukázala (9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17), že ide o užitočný prognostický ukazovateľ. Sú však aj práce (18, 19, 20), ktoré sa s uvedenými závermi celkom nestotožňujú. V našom príspevku sme sa zamerali na kvantitatívne hodnotenie proliferačnej aktivity (Ki-67 indexu) malígneho melanómu a jej vzťahu s ostatnými histopatologickými parametrami nádoru.

Materiál a metódy

Súčasťou štúdie bolo 24 primárnych malígnych melanómov kože v invazívnom štádiu rastu, pri ktorých sme mohli objektívne hodnotiť všetky štandardné histomorfologické parametre a ktoré mali v rámci biop sie imunohistochemicky vyšetrovaný aj Ki-67 antigén. Histologicky išlo o povrchovo sa šíriaci melanóm (n = 13), nodulárny melanóm (n = 9) a melanóm z malígneho lentiga (n = 2). Všetky nádory boli odobrané kompletnou chirurgickou excíziou a diag nostikované na oddelení patologickej anatómie FNsP v Žiline v období rokov 2009 – 2012. Získané boli od 24 pacientov (13 mužov, 11 žien) vo vekovom rozpätí 31 – 81 rokov (priemerný vek 57,2 roka). Topografická distribúcia nádorov v súbore bola nasledujúca: chrbát (n = 10), horná končatina (n = 4), predná časť trupu (n = 3), hlava a krk (n = 3), dolná končatina (n = 3) a perineum (n = 1). Vzorky sme po zaliatí do formalínu štandardne histologicky spracovali vo forme parafínových bločkov, farbili hematoxylínom a eozínom a podľa potreby špeciálnymi histochemickými a imunohistochemickými metodikami a hodnotili vo svetelnom mikroskope. Proliferačnú aktivitu (Ki-67 index) nádorových buniek sme stanovovali imunohistochemicky myšou monoklonovou protilátkou proti Ki-67 antigénu (klon MIB-1, DAKO, riedenie 1 : 100). Podľa práce autorov Ramsay et al. (14) sme rozlišovali 3 semikvantitatívne stupne Ki-67 imunoreaktivity: stupeň I ( 20 % pozitívnych buniek). Mitotickú aktivitu sme konvenčne (11) klasifikovali na 2 prognostické kategórie: a)

Výsledky

Priemerný Ki-67 index vyšetrovaných melanómov bol 14,3 % s pomerne širokým variačným rozptylom (2 – 50 %) medzi jednotlivými prípadmi. Z definovaných troch semikvantitatívnych stupňov sa najčastejšie vyskytoval stupeň II (n = 11), po ňom nasledoval stupeň I (n = 9) a stupeň III (n = 4). Hodnota Ki-67 indexu vo všeobecnosti stúpala so zvyšujúcim sa Breslowým indexom a tým aj patologickým štádiom (pT) choroby. V skupine I prevládali najmä „tenké“ melanómy (77,8 %) s hrúbkou ≤ 1 mm, v skupine III dominovali „hrubé“ melanómy (75 %) s Breslowým indexom nad 4 mm.

Najnižší priemerný Ki-67 index bol pri melanóme z malígneho lentiga (4 %), vyšší pri povrchovo sa šíriacom melanóme (9,4 %) a najvyšší pri nodulárnom melanóme (23,9 %) (obr. 1 a 2), hoci aj tento fakt súvisel s pT štádiom, keďže nodulárne melanómy vykazovali najvyššie hodnoty Breslowho indexu. So stúpajúcim Ki-67 indexom (stupeň I vs. II. vs. III) narastala priemerná hodnota počtu mitóz (0,9 vs. 4,8 vs. 17 mitóz), ako aj zastúpenie prognosticky nepriaznivej kategórie melanómov s počtom mitóz ≥ 6 na l0 zorných polí pri veľkom zväčšení (0 % vs. 27,3 % vs. 75 %), častejšie sa vyskytoval nepriaznivý histologický prognostický index ≥ 19 (11,1 % vs. 54,6 % vs. 100 %), stúpal výskyt nádorových satelitov/mikrosatelitov (0 % vs. 9 % vs. 25 %), ako aj invázie nádoru do ciev (11,1 % vs. 18,2 % vs. 50 %). V jedinom prípade s potvrdenými metastázami v regionálnych lymfatických uzlinách (dve postihnuté uzliny, štádium choroby pT4b,pN2b) mal primárny nádor Ki-67 index 50 % (stupeň III). Vzťah jednotlivých semikvantitatívnych stupňov Ki-67 indexu a ostatných histomorfologických nálezov vyšetrovaných melanómov je uvedený v tabuľke 1.

Diskusia

Pri zhubnom melanóme kože sa v literatúre uvádza priemerný Ki-67 index v rozpätí 14 – 27 % (11, 16, 23), nami potvrdená hodnota 14,3 % je teda na dolnej hranici tohto rozpätia. Podľa väčšiny štúdií (9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17) súvisí narastajúca proliferačná aktivita (Ki-67 index) malígneho melanómu s nepriaznivými klinicko-patologickými ukazovateľmi indikujúcimi horšiu prognózu a kratšie prežívanie pacientov. Hoci sú naše výsledky limitované malým počtom vyšetrovaných nádorov, aj my môžeme konštatovať, že vzostup semikvantitatívnych stupňov Ki-67 indexu bol sprevádzaný zvyšujúcou sa mitotickou aktivitou, Breslowým indexom, histologickým prognostickým indexom, častejším výskytom nádorových satelitov alebo mikrosatelitov, ako aj častejšie prítomnou inváziou nádoru do ciev. V jedinom prípade s verifikovanými metastázami v regionálnych lymfatických uzlinách mal primárny nádor Ki-67 index až 50 %. Na základe týchto výsledkov a v kontexte s uvedenými publikáciami teda možno považovať Ki-67 index za relevantný indikátor malígneho potenciálu a biologického správania melanómu kože. Niektorí autori (10) dokonca navrhli aj klinický prognostický algoritmus, ktorý ako jeden z parametrov zahrňuje aj Ki-67 index. Zistili, že najväčšie riziko metastázovania majú mitogénne melanómy s Ki-67 indexom ≥ 20 %. Diskutujú o možnej stratifikácii pacientov na „vysokorizikovú“ a „nízkorizikovú“ skupinu, ktorá by bola založená aj na hodnote proliferačnej aktivity nádorových buniek, na základe čoho by bolo možné prispôsobiť liečebnú stratégiu.

Z biologického hľadiska je zaujímavé, že proliferačná aktivita zhubného melanómu kože je v porovnaní s karcinómami epidermového pôvodu pomerne nízka, a pritom ide o jeden z najagresívnejších nádorov u ľudí, ktorého prognóza je neporovnateľne horšia než prognóza spinocelulárneho či bazocelulárneho karcinómu kože. Podľa jednotlivých štúdií je priemerná rastová frakcia (Ki-67 index) spinocelulárneho karcinómu kože 32,9 – 35,5 % (24, 25, 26) a bazocelulárneho karcinómu kože 20 – 41 % (24, 25, 26, 27, 28). Uvedená skutočnosť poukazuje na odlišné molekulové mechanizmy evolúcie a progresie malígneho melanómu kože, ktoré sú vo významnej miere ovplyvňované aj inými než proliferačnými faktormi. Mooney et al. (29) už v staršej štúdii pozorovali, že primárny bazocelulárny karcinóm má v porovnaní s primárnym melanómom omnoho vyšší pomer apoptotických a mitotických buniek. V praxi to znamená, že hoci je bazocelulárny karcinóm proliferačne aktívnejším nádorom, zároveň vykazuje aj vysokú apoptotickú aktivitu, ktorá zapríčiňuje kontinuálny zánik buniek a pravdepodobne zodpovedá za jeho pomalý rast a vcelku „nezávažné“ biologické správanie. Molekulová patogenéza zhubného melanómu je veľmi zložitá a podieľa sa na nej široké spektrum regulátorov bunkového cyklu, apoptózy, transkripčných faktorov a receptorov sprostredkujúcich vzájomné epitelovo-mezenchýmové interakcie. Tieto biomarkery zohrávajú špecifický význam v jednotlivých štádiách karcinogenézy (17). S výnimkou nodulárneho melanómu rozlišujeme 3 fázy progresie choroby (17): radiálnu rastovú fázu, vertikálnu rastovú fázu a fázu metastázovania, pričom každá z nich je charakteristická odlišnými genetickými zmenami a rozdielnou expresiou molekulových markerov. Alonso et al. (17) v imunohistochemickej štúdii 39 biomarkerov poukázali, že expresia Ki-67 zohráva najväčší význam v progresii melanómu z radiálnej do vertikálnej rastovej fázy (tabuľka 2). Tieto výsledky potvrdzujú aj Gimotti et al. (10) ktorí pozorovali, že v tumorigénnej vertikálnej rastovej fáze je Ki-67 imunoreaktivita nádorových buniek v derme výrazne vyššia v porovnaní s radiálnou rastovou fázou.

V tejto súvislosti je taktiež vhodné spomenúť, že pri melanóme kože je kontroverzný aj vzájomný vzťah proliferačnej a mitotickej aktivity nádorových buniek, hoci obidva tieto parametre odzrkadľujú aktuálny stav bunkového cyklu a ich replikačný potenciál. Niektorí autori (10, 16) potvrdili medzi nimi priamu koreláciu, iní nie (11). Jedným z dôvodov tejto diskrepancie môže byť aj fakt, že pokým Ki-67 antigén znázorňuje všetky fázy bunkového cyklu, počas ktorých sú bunky proliferačne aktívne, mitotický index označuje iba bunky v mitóze, predstavujúce len určitú časť tohto cyklu (11). Z tohto pohľadu sa teda zdá byť relevantnejším parametrom mitotic-ká aktivita, keďže tá definuje reálne sa množiacu bunkovú populáciu a je aj objektívnejšie hodnotiteľná než proliferačný index. Na druhej strane Ki-67 index označuje populáciu proliferujúcich buniek, z ktorých všetky majú aktuálny potenciál stať sa mitoticky aktívnymi a niektorí autori uvádzajú (16), že pri melanóme má vyššiu prognostickú hodnotu než mitotická aktivita.

Záver

V našom súbore histologicky vyšetrených malígnych melanómov kože bola priemerná hodnota proliferačnej aktivity (Ki-67 indexu) na dolnej hranici rozpätia uvádzaného v literatúre. V zhode s väčšinou iných štúdií sme potvrdili, že jej vzostup bol sprevádzaný častejším výskytom prognosticky nepriaznivých histopatologických ukazovateľov nádoru. K skutočnému prognostickému významu Ki-67 indexu a jeho vzťahu s klinickým priebehom choroby a prežívaním postihnutých osôb sa však bude možné vyjadriť až po dlhšom období sledovania väčšieho počtu pacientov.

Poďakovanie

Ďakujeme všetkým lekárom FNsP v Žiline, ktorý sa podieľali na diagnosticko-terapeutickom procese pacientov v prezentovanom súbore.

Literatúra

1. Strmeňová V, Minariková E. Malígny melanóm kože. 1 vydanie, Martin: Osveta, 2005; 79 s. ISBN 80-8063-177-8 2
2. Minariková E, Pullmann R, Karafová N et al. Klinické využitie S-100 proteínu ako nádorového markera malígneho melanómu. Čes-slov Dermatol, 2003; 78 (4): 156-158. 3
3. Adamkov M, Lauko Ľ, Rajčáni J et al. Expression of antiapoptotic protein survivin in malignant melanoma. Biologia, 2009; 64 (4): 840-844.
4. Bobrovská M, Minariková E, Plank L. Diagnostika malígneho melanómu. Onkológia (Bratisl), 2009; 4 (3): 144-148. 5
5. Minariková E, Péč J, Lauko Ľ et al. Výskyt klinicko-histopatologických typov malígnych melanómov a ich lokalizácií u pacientov v Žilinskom kraji, okresoch Považská Bystrica, Púchov a Ilava v rokoch 1997 – 1999. Čes-slov Derm, 2001; 76 (3): 122-125.
6. Minariková E, Targierd MW. Anatomická distribúcia a výskyt nových prípadov malígnych melanómov za dve sledované obdobia desiatich rokov (1992-2001) a piatich rokov (2005-2009). Derma, 2011; 11 (2): 3-7.
7. Strmeňová V, Minariková E, Lauko Ľ. Incidencia malígneho melanómu kože. Slov Lek, 2002; 12 (26), (7-8): 261-262.
8. Homsi J, Kashani-Sabet M, Messina JL, Daud A. Cutaneous melanoma: Prognostic factors. Cancer Control, 2005; 12 (4): 223-229.
9. Pearl RA, Pacifico MD, Richman PI et al. Ki-67 expression in melanoma. A potential method of risk assessment for the patient with a positive sentinel node. J Exp Clin Cancer Res, 2007; 26 (1): 109-115.
10. Gimotty PA, Van Belle P, Elder DE et al. Biologic and prognostic significance of dermal Ki67 expression, mitoses, and tumorigenicity in thin invasive cutaneous melanoma. J Clin Oncol, 2005; 23 (31): 8048-8056.
11. Henrique R, Azevedo R, Bento MJ et al. Prognostic value of Ki-67 expression in localized cutaneous malignant melanoma. J Am Acad Dermatol, 2000; 43 (6): 991-1000.
12. Özgün E, Seckin S, Ergöcen S. The importance of Ki-67 in differential diagnosis of intradermal melanocytic nevus, dysplastic nevus and malignant melanoma, and comparison of Ki-67 with prognostic factors of malignant melanoma. Turkiye Klinikleri J Dermatol, 2009; 19 (4): 184-192
13. Hazan C, Meizer K, Panageas KS et al. Evaluation of the proliferation marker MIB-1 in the prognosis of cutaneous malignant melanoma. Cancer, 2002; 95 (3): 634-640.
14. Ramsay JA, From L, Iscoe NA, Kahn HJ. MIB-1 Proliferative activity is a significant prognostic factor in primary thick cutaneous melanomas. J Investig Dermatol, 1995; 105 (1): 22-26.
15. Vogt T, Zipperer KH, Vogt A et al. p53-protein and Ki-67-antigen expression are both reliable biomarkers of prognosis in thick stage I nodular melanomas of the skin. Histopathology 1997; 30 (1): 57-63.
16. 16 Ladstein RG, Bachmann IM, Straume O, Akslen LA. Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma. BMC Cancer, 2010; 10: 140.
17. Alonso SR, Ortiz P, Pollán M et al. Progression in cutaneous malignant melanoma is associated with distinct expression profiles: a tissue microarray-based study. Am J Pathol, 2004; 164 (1): 193-203.
18. Reddy VB, Gattuso P, Aranha G, Carson HJ. Cell proliferation markers in predicting metastases in malignant melanoma. J Cutan Pathol 1995; 22 (3): 248-251.
19. Talve LA, Collan YU, Ekfors TO. Nuclear morphometry, immunohistochemical staining with Ki-67 antibody and mitotic index in the assessment of proliferative activity and prognosis of primary malignant melanomas of the skin. J Cutan Pathol 1996; 23 (4): 335-343.
20. Ilmonen S, Hernberg M, Pyrhönen S et al. Ki-67, Bcl-2 and p53 expression in primary and metastatic melanoma. Melanoma Res, 2005; 15 (5): 375-381.
21. Schmoeckel C, Braun-Falco O. Prognostic index in malignant melanoma. Arch Dermatol, 1978; 114 (6): 871-873.
22. Kopf AW, Gross DF, Rogers GS et al. Prognostic index for malignant melanoma. Cancer, 1987; 59 (6): 1236-1241.
23. Nasr MR, El-Zammar O. Comparison of pHH3, Ki-67, and survivin immunoreactivity in benign and malignant melanocytic lesions. Am J Dermatopathol, 2008; 30 (2): 117-122.
24. Al-Sader MH, Doyle E, Kay EW et al. Proliferation indexes – a comparision between cutaneous basal and squamous cell carcinomas. J. Clin. Pathol., 1996; 49 (7): 549-551.
25. Matsuta M, Kimura S, Kosegawa G et al. Immunohistochemical detection of Ki-67 in epithelial skin tumors in formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections using a new monoclonal antibody (MIB-1). J Dermatol, 1996; 23 (3): 147-152.
26. Batinac T, Zamolo G, Jonjic' N et al. p53 protein expression and cell proliferation in non-neoplastic and neoplastic proliferative skin diseases. Tumori, 2004; 90 (1): 120-127.
27. Tilli CM, Stavast-Koey AJ, Ramaekers FC, Neumann HA. Bax expression and growth behavior of basal cell carcinomas. J Cutan Pathol, 2002; 29 (2): 79-87.
28. Mazzarelli P, Rabitti C, Parella P et al. Differential modulation of Ku70/80 DNA-binding activity in a patient with multiple basal cell carcinomas. J Invest Dermatol, 2003; 121 (3): 628-633.